從小鼠胚胎中分離胚胎干細(xì)胞的方法

日期：2025-07-09 20:27

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摘要：

設(shè)備和試劑
--6厘米**培養(yǎng)皿

--M2培養(yǎng)基+1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma）
--M16培養(yǎng)基+ 1毫克/毫升牛血清白蛋白（sigma）
--BLS胚胎聚集針（DN-10 或DN-09）

--ES細(xì)胞單細(xì)胞懸液

--窄口移液管（處理細(xì)胞和胚胎）來自Pasteur移液管或其他合適的玻璃毛細(xì)管（移液管內(nèi)徑的應(yīng)? 100μm ）

--來自雌性促排卵的八細(xì)胞胚胎

-- Tyrode’s液，酸性（ sigma）
--CO2孵化器

A：準(zhǔn)備聚集穴
1.在**培養(yǎng)皿滴6 滴M16培養(yǎng)培養(yǎng)基+牛血清白蛋白，然后覆上石蠟油

2. 胚胎聚集針（BLS DN-10或DN-09）通過石蠟油和培養(yǎng)基按壓塑料表面，在每滴下面制作出 12-16個(gè)低壓穴，胚胎聚集針（BLS DN-10或DN-09）需用酒精清洗

3.將培養(yǎng)基放置于孵化器內(nèi)，用CO2預(yù)均衡培養(yǎng)基

B.ES細(xì)胞的制備

1.將ES單細(xì)胞懸液放置在**培養(yǎng)皿中的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育1-2小時(shí)。在此期間，它們將會(huì)聚集成由5-10個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞部落。

2．使用窄口移液管將ES細(xì)胞落（5-10個(gè)細(xì)胞）放入聚集穴內(nèi)。

C.胚胎制備和聚集
1.從2.5天促排卵或自然交配的小鼠輸卵管提取八倍體胚胎并在M2培養(yǎng)基中沖洗。

2.用3滴M2培養(yǎng)基清洗胚胎
3.通過簡短的接觸酸性灌流液除去胚胎透明帶。用移液管在一滴酸Tyrode’s液上釋放10-20胚胎，保持胚胎懸浮在溶液中，直到透明帶溶解。注意不要讓胚胎落到液體的底部并接觸塑料，以免刺穿。

4.將胚胎轉(zhuǎn)移回M2培養(yǎng)基
5.通過四滴M16 + BSA培養(yǎng)基清洗胚胎。
6.在預(yù)先準(zhǔn)備好的聚集穴中，將一個(gè)胚胎與每個(gè)胚胎細(xì)胞落接觸

7.將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)至孵化箱內(nèi)，孵化一晚。
8.將壓縮的或早期空泡桑椹胚移植到受體**角

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